Cell  Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒)

产品信息：

CCK-8试剂通过使用高度水溶性的四唑盐WST-8实现了非常方便的检测。在电子载体存在的情况下WST-8被还原成一种水溶性的甲臜染料，如图1所示。CCK-8 是一种单瓶溶液，不需要使用前预混。CCK-8采用灵敏的比色法检测，以确定细胞增殖和细胞毒性检测中的活细胞数量。WST-8 被细胞中的脱氢酶还原成一种黄色产物（甲臜），该产物可溶于细胞培养基中（见图1）。由细胞中脱氢酶催化产生的甲臜染料的量与活细胞的数量成正比。WST-8的检测灵敏度高于其他四唑盐，如MTT、XTT、MTS或WST-1。

将含不同数量HEK293细胞的细胞悬液按照每孔100 μL接种到96孔板中，在37°C，5% CO₂条件下过夜培养，在每孔加入10 μL的不同品牌CCK-8试剂后，将96孔板在37℃条件下孵育2小时后测定A₄₅₀

优点：

单瓶，不需要使用前预混；

不需要有机溶剂或同位素；

无需收集、清洗和溶解等步骤，操作简便。

比MTT、XTT、MTS或WST-1更灵敏。

储存方式：

CCK-8试剂需避光保存，在-20℃可保存2年，在4℃可保存1年，在室温则可保存6个月。注意反复冻融会导致背景增加，从而干扰检测。

使用CCK-8所需设备和材料：

1）微孔板酶标仪（有450 nm滤光片）

2）96孔板

3）10 μL，100 μL的多道移液器

4）二氧化碳培养箱

细胞增殖的检测方法：

1）在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔），在37°C，5% CO₂条件下过夜培养。

2）如果CCK-8试剂是冷冻的，则在室温或37°C的水浴中解冻CCK-8试剂。

3）向接种了细胞的96孔板按每孔加入10 μL CCK-8试剂。

注意：小心不要引入气泡，因为它们会干扰吸光度读数。

4）在培养箱中孵育96孔板1-4小时。

5）使用微孔板酶标仪在450 nm处测量吸光度。

注意：如果以后仍会测量吸光度，向96孔板按每孔加入10 μL 1% w/v SDS溶液，盖上盖子，并在室温下避光保存。吸光度在48小时内不会发生变化。

细胞毒性的检测方法：

1）在96孔板中接种100 μL的细胞悬液（5000个细胞/孔），在37℃，5% CO₂条件下过夜培养；

2）向接种了细胞的96孔板按每孔加10 μL各种浓度的毒物；

3）将96孔板在37℃，5% CO₂条件下培养一定时间（例如，6、12、24或48小时）。

4）如果CCK-8试剂是冷冻的，则在室温或37°C的水浴中解冻CCK-8试剂。

注意：小心不要引入气泡，因为它们会干扰吸光度读数。

5）向接种了细胞的96孔板按每孔加入10 μL CCK-8试剂。

6）在培养箱中孵育96孔板1-4小时。

7）使用微孔板酶标仪在450 nm处测量吸光度。

注意：如果以后仍会测量吸光度，向96孔板按每孔加入10 μL 1% w/v SDS溶液，盖上盖子，并在室温下避光保存。吸光度在48小时内不会发生变化。

背景控制：

加入CCK-8试剂的培养基会出现轻微的自发吸光度，最大吸收波长约为460 nm。这种背景吸光度取决于培养基、pH值、孵育时间和光照时间。孵育2小时后的典型背景吸光度为0.1-0.2吸光单位。为了纠正这一点，请准备一个或多个不含细胞的对照孔，并将对照孔的平均吸光度从其他孔中减去。

注意事项：

1）由于CCK-8检测是基于活细胞中的脱氢酶活性，因此影响活细胞中脱氢酶活性的条件或化学物质可能会导致实际存活细胞数量与使用CCK-8检测确定的细胞数量之间的差异；

2）WST-8可能会与还原剂反应生成甲臜。如果在细胞毒性检测或细胞增殖检测中使用还

原剂，请检查背景吸光度；

3）小心不要引入气泡，因为它们会干扰吸光度读数；

4）含酚红的培养基可以用此试剂盒进行细胞活力检测；

5）CCK-8试剂的孵育时间因孔中的细胞类型和数量而异。一般来说，白细胞的着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（最长可达4小时）或大量细胞（约100000个细胞/孔）；

6）由于该试剂盒的细胞毒性非常低，因此在读数后仍可以进一步显色。

常见问题：

1）每孔应该有多少细胞？

对于贴壁细胞，当使用标准96孔板时，每孔至少需要1000个细胞。对于悬浮细胞，每孔至少需要2500个细胞。96孔板每孔的推荐最大细胞数为25000个。如果使用24孔或6孔板进行此检测，请相应地计算每孔的细胞数，并将每孔的CCK-8试剂体积调整为总体积的10%。

2）CCK-8试剂的稳定性如何？

CCK-8试剂在-20°C下稳定2年，在4°C下稳定1年，在室温下稳定6个月。

3）酚红会影响检测吗？

不会。可以通过减去不含细胞的对照孔的吸光值来消除培养基中酚红的吸光值。因此，含酚红的培养基可用于CCK-8检测。

4）脱氢酶抑制剂如丙二酸会影响检测吗？

是的。CCK-8检测基于活细胞中的脱氢酶活性。因此，任何影响细胞内脱氢酶活性的因素（如温度变化和脱氢酶抑制剂）都会影响检测结果。

5）CCK-8试剂会与含还原性化合物的溶液反应生成甲臜吗？

会。当CCK-8试剂与含有还原性化合物的溶液共存，请检查背景吸光度。

6）染料与脱氢酶之间反应的最适pH是多少？

在pH 7.4时，WST-8与电子介质反应生成甲臜的活性最强。

7）含血清的培养基可用于CCK-8检测吗？

是的。CCK-8可用于含10%胎牛血清的完全培养基。血清不会影响检测。

8）使用不同类型的培养基是否有差异？

会。含酚红的培养基会显示略高的背景，可以通过减去不含细胞的对照孔的吸光值来消除培养基中酚红的吸光值。

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